при каких условиях следует проводить электрофорез смеси двух белков если их изоэлектрические точки

Содержание

Электрофорез белков сыворотки крови: показания к проведению исследования, расшифровка результатов
Электрофорез белков сыворотки крови: общая информация
Электрофорез белков сыворотки крови: цели исследования
Электрофорез белков сыворотки крови: показания
Референсные значения белковых фракций сыворотки крови
Причины нарушения баланса белковых фракций в сыворотке крови
Альбумин
Альфа-1-глобулин
Альфа-2-глобулин
Бета-глобулин
Гамма-глобулин
Электрофорез белков сыворотки крови: подготовка к проведению исследования
Электрофорез белков: где сделать?
Архив
Анализ протеинограммы
При каких условиях следует проводить электрофорез смеси двух белков если их изоэлектрические точки
При каких условиях следует проводить электрофорез смеси двух белков если их изоэлектрические точки

Электрофорез белков сыворотки крови: показания к проведению исследования, расшифровка результатов

Электрофорез белков сыворотки крови (протеинограмма) является лабораторным исследованием, позволяющим определить количественные и качественные изменения основных белковых фракций. Данное исследование позволяет выявить острые и хронические воспаления инфекционной и неинфекционной природы, онкологические (моноклональные гаммапатии) и многие другие патологии, а также контролировать их лечение.

Благодаря ультрасовременной аппаратуре Юсуповской больницы и огромному опыту наших высококвалифицированных диагностов, грамотно интерпретирующих результаты исследования, обеспечиваются максимально точные результаты анализа в короткие сроки. Комплексным обследованием занимается мультидисциплинарная команда врачей, которые, в целях уточнения диагноза, назначают электрофорез белков сыворотки крови и другие высокотехнологичные лабораторные и инструментальные исследования, позволяющие выявить патологию на ранних стадиях развития, благодаря чему каждому пациенту подбирается наиболее эффективная индивидуальная схема лечения.

Электрофорез белков сыворотки крови: общая информация

В состав общего белка сыворотки крови входят альбумины и глобулины, которые в норме находятся в определенных качественных и количественных соотношениях. Для оценки соотношения альбумина и глобулина в крови проводится электрофорез белков с применением агарозного геля.

Изменение качественного и количественного соотношения в протеинограмме может свидетельствовать о наличии в организме самых различных заболеваний (от вирусного гепатита до хронической сердечной недостаточности).

Для постановки точного диагноза, кроме результатов электрофореза белков крови, специалисты Юсуповской больницы назначают дополнительные клинические, лабораторные и инструментальные исследования.

Электрофорез белков сыворотки крови: цели исследования

Электрофорез белков крови позволяет точно оценить качественное и количественное соотношение основных белковых фракций у пациентов, страдающих следующими патологиями:

Электрофорез белков сыворотки крови: показания

Электрофорез белков сыворотки крови является довольно информативным исследованием, которое назначается пациентам Юсуповской больницы при подозрении на следующие заболевания и состояния:

Референсные значения белковых фракций сыворотки крови

Нормальными значениями общего белка у детей считаются 44-80 г/л, в зависимости от возраста ребенка, у взрослых людей – от 64 до 83 г/л.:

Причины нарушения баланса белковых фракций в сыворотке крови

Изменение баланса тех или иных белковых фракций крови может сигнализировать о наличии в организме каких-либо патологических процессов.

Альбумин

Фракция альбумина может быть повышена при:

Фракция альбумина понижается при:

Альфа-1-глобулин

Фракция альфа-1-глобулина повышается при:

Фракция альфа-1-глобулина понижается при:

Альфа-2-глобулин

Фракция альфа-2-глобулина повышается при:

Фракция альфа-2-глобулина понижается при:

Бета-глобулин

Фракция бета-глобулина повышается при:

Фракция бета-глобулина понижается при:

Гамма-глобулин

Фракция гамма-глобулина повышается при:

Фракция гамма-глобулина понижается при:

Электрофорез белков сыворотки крови: подготовка к проведению исследования

За 12-15 часов до исследования рекомендуется отказаться от приема пищи.

Минимум за час-полтора до забора крови для анализа необходимо избегать физического и эмоционального перенапряжения, исключить курение.

Во избежание получения искаженных результатов не стоит проводить электрофорез белков сыворотки крови сразу после процедуры гемодиализа и процедур с использованием радиоконтрастных веществ. Необходимо также исключить прием пенициллина, который может привести к расщеплению полосы альбумина.

Электрофорез белков: где сделать?

Электрофорез белков сыворотки крови является важной частью комплексного обследования пациентов в Юсуповской больнице. Данное исследование назначается при подозрении на наличие в организме той или иной из вышеперечисленных патологий.

Узнать стоимость услуг лабораторной диагностики и записаться на проведение исследования можно по телефону или онлайн на сайте Юсуповской больницы.

Источник

Анализ протеинограммы

Th. X. O’Connell, T. J. Horita, B. Kasravi
Am Fam Physician 2005;71:105-12

Анализ белков сыворотки крови (протеинограмма) с помощью электрофореза часто используется для выявления больных с множественной миеломой и другой патологией белков крови. Многие узкие специалисты включают данный тест в план первичного обследования по поводу многих заболеваний. Однако иногда результаты протеинограммы интерпретировать тяжело.

В данной статье подробно рассматривается методика электрофорезографии, показания, интерпретация протеинограммы и приведены рекомендации относительно дальнейшего обследования пациентов с патологическими результатами теста.

Электрофорез — метод разделения белков в зависимости от их физических свойств (размера, формы и полярности электрического заряда молекулы). Сыворотка крови наносится на специальную среду, через которую впоследствии пропускается ток.

Белковый состав сыворотки крови

Результат электрофореза белков плазмы крови зависит от состава фракций двух основных типов белков: альбуминов и глобулинов. Альбумин — основной белковый компонент сыворотки крови — в нормальных физиологических условиях синтезируется в печени. Глобулины составляют значительно меньшую фракцию протеинового состава сыворотки крови. Интерпретация протеинограммы заключается прежде всего в анализе белковых фракций и их относительного количества.

Альбумин — наивысший пик протеинограммы — располагается ближе всего к положительному электроду. Следующие пять компонентов (глобулины), последовательно располагающиеся все ближе к отрицательному электроду, обозначаются соответственно α₁, α₂, β₁, β₂ и γ. На рисунке 1 приведен образец распределения белков сыворотки крови при помощи электрофореза в норме.

Рис. 1. Результат электрофореза белков плазмы крови в норме.

Альбумин представляет наибольшую белковую фракцию сыворотки крови человека. Его уровень снижается при нарушении синтезирующей функции печени и при повышенной потере или распаде данного белка. К снижению уровня альбумина приводят нарушения питания, тяжелые заболевания печени, потеря через почки (например, при нефротическом синдроме), гормонотерапия, ожоги и беременность, а к повышению — состояния, сопровождающиеся снижением относительного содержания воды в сыворотке крови (например, дегидратация).

β-фракция глобулинов делится на два пика: β₁ (состоит преимущественно из трансферрина) и β₂ (β-липопротеин). К β-фракции также относятся факторы комплемента, IgA, IgM и иногда IgG.

Основное внимание клиницистов приковано к γ-фракции, поскольку она содержит иммуноглобулины, хотя данные белки при электрофорезе могут мигрировать и в другие фракции. С-реактивный белок находится между β- и γ-фракциями.

Показания к назначению протеинограммы

Электрофорез белков сыворотки крови, как правило, назначается при подозрении на множественную миелому, хотя есть и другие показания (таблица 1).

Таблица 1. Показания к назначению протеинограммы с помощью электрофореза

В ответ на острое воспаление, злокачественное заболевание, травму, некроз, инфаркт, ожоги и химическое поражение в плазме возрастает уровень так называемых “белков острой фазы”: фибриногена, антитрипсина, гаптоглобулина, церулоплазмина, С-реактивного белка, C₃-фракции комплемента и α₁-кислотного гликопротеина. Часто также снижается уровень альбумина и трансферрина. В таблице 2 приведены изменения состава белков острой фазы, характерные для определенных заболеваний.

Таблица 2. Заболевания и клинические состояния, связанные с характерными изменениями содержания белков острой фазы в протеинограмме

При интерпретации результатов электрофореза белков сыворотки крови основное внимание уделяется гамма-фракции, состоящей в основном из антител класса IgG. Хотя гамма-фракция может возрастать вследствие многих причин, есть несколько заболеваний, приводящих к появлению гомогенного острофазового пика в зоне гамма-глобулинов (рис. 2). Эти так называемые “моноклональные гаммапатии” составляют группу заболеваний, характеризующихся пролиферацией одного клона плазматических клеток, синтезирующих гомогенный М-белок.

Рис. 2. Патологический результат электрофореза белков сыворотки крови у больного с множественной миеломой. Обратите внимание на большой острофазовый пик в гамма-фракции.

Дифференциальная диагностика моноклональных и поликлональных гаммапатий

Очень важно отдифференцировать моноклональные гаммапатии от поликлональных, поскольку моноклональные гаммапатии связаны со злокачественным либо потенциально злокачественным клональным процессом, а поликлональные, наоборот, с какими-либо, как правило, незлокачественными реактивными или воспалительными изменениями. В таблице 3 приведены наиболее частые этиологические факторы поликлональной гаммапатии.

Таблица 3. Дифференциальная диагностика поликлональной гаммапатии

М-парапротеин характеризуется наличием на электрофорезограмме острофазовой, четкой полосы, состоящей из одной тяжелой цепи, и подобной полосы с κ- или λ-легкой цепью. При поликлональной гаммапатии присутствует широкая диффузная полоса с одной или несколькими тяжелыми и κ- и λ-легкими цепями.

После выявления моноклональной гаммапатии при помощи электрофореза белков сыворотки крови следует отдифференцировать множественную миелому от других факторов данного типа гаммапатий: макроглобулинемии Вальденстрема, солитарной плазмоцитомы, латентной множественной миеломы, эссенциальной моноклональной доброкачественной гаммапатии, плазмоклеточного лейкоза, болезни тяжелых цепей и амилоидоза.

Количественное содержание М-парапротеина может помочь в дифференциальной диагностике между множественной миеломой и эссенциальной моноклональной доброкачественной гаммапатией. Критерием постановки диагноза множественной миеломы является выявление поражения 10–15% плазматических клеток в биоптате костного мозга. В таблице 4 приведены характерные дифференциальные симптомы моноклональных гаммапатий.

Таблица 4. Характерные признаки моноклональных гаммапатий
(по E. D. George, R. Sadovsky, 1999)

Наличие M-парапротеина в форме узкого пика в γ-, β- или α₂-фракции.

Уровень M-протеина, как правило, превышает 30 г/л.

Наличие у 80% пациентов скелетных поражений (например, литических поражений, диффузной остеопении, компрессионных переломов позвонков).

Для постановки диагноза необходимо наличие поражения 10–15% плазмоцитов в биоптате костного мозга.

Возможна анемия, панцитопения, гиперкальциемия и поражение почек

Эссенциальная моноклональная доброкачественная гаммапатия

Уровень M-протеина ниже 30 г/л.

Наличие плазмоцитов в биоптате костного мозга 10%.

Отсутствие у больных литических поражений костей, анемии, гиперкальциемии и поражения почек.

Наличие в анализе периферической крови более 20% плазмоцитов.

Уровень M-парапротеина низкий.

Наличие небольшого числа поражений костей и изменений состава крови.

Встречается у больных младшего возраста

Наличие только одного очага опухоли без каких-либо других очаговых поражений костей, патологии со стороны мочи или сыворотки крови

Наличие M-парапротеина класса IgM.

Повышенная вязкость крови, обогащенный клеточный состав костного мозга с выраженной инфильтрацией лимфоплазмоцитами

Болезнь тяжелых цепей

M-парапротеин состоит из неполной тяжелой цепи при отсутствии легкой цепи

У некоторых пациентов с дискразией плазматических клеток результат электрофореза белков сыворотки крови может быть нормальным вследствие отсутствия моноклонального иммуноглобулина или очень низкой его концентрации. В исследовании Kyle R. A. (1999) было установлено, что острофазовый пик или локализованную полосу патологического иммуноглобулина при помощи электрофореза удается обнаружить только у 82% больных с множественной миеломой. У остальных пациентов была обнаружена гипогаммаглобулинемия или вариант нормы. Поэтому всем больным с подозрением на дискразию плазмоцитов рекомендуется проводить электрофорез белков мочи.

Следует также учитывать количество М-парапротеина. Хотя у больных с множественной миеломой его содержание превышает 30 г/л, у 1/5 таких пациентов оно ниже 10 г/л. Приблизительно у 10% пациентов с множественной миеломой и отсутствием М-пика при электрофорезе обнаруживается гипогаммаглобулинемия. У большинства таких пациентов в моче обнаруживается белок Бенс-Джонса (моноклональные свободные κ- или λ-цепи иммуноглобулинов) в большом количестве. Поэтому количественное содержание М-парапротеина не позволяет исключить множественную миелому.

Если у пациента с отсутствием пика М-парапротеина при электрофорезе белков сыворотки крови на основании клиники подозревается множественная миелома, следует провести электрофорез белков мочи.

Обследование больных с патологическими результатами протеинограммы

Моноклональная гаммапатия обнаруживается у 8% здоровых гериатрических пациентов. Всем больным с моноклональной гаммапатией следует проводить дальнейшее исследование с целью определения ее этиологии. Пациенты с эссенциальной моноклональной доброкачественной гаммапатией требуют тщательного диспансерного наблюдения, поскольку в данной категории лиц с частотой приблизительно 1% в год развивается множественная миелома или другая злокачественная моноклональная гаммапатия. На рисунке 3 приведен алгоритм диспансерного наблюдения за больными с моноклональной гаммапатией.

Рисунок 3. Схема диспансерного наблюдения за больными с моноклональной гаммапатией (по R. A. Kyle, 1999). Примечания. ЭБСК — электрофорез белков сыворотки крови.

1 Нефелометрия применяется для количественного определения иммуноглобулинов.

2 Собирается суточная моча для исследования по методу электрофореза и иммунофиксации.

3 Обследование костей включает обзорную рентгенографию плечевых и бедренных костей в одной проекции.

4 Данные тесты показаны при подозрении на макроглобулинемию Вальденстрема или другие лимфопролиферативные процессы.

5 Если при повторном ЭБСК обнаружены патологические изменения, пациента следует направить к гематологу-онкологу.

Если концентрация М-парапротеина составляет 15–25 г/л, следует провести нефелометрию для количественного определения присутствующих иммуноглобулинов и собрать суточную мочу для анализа при помощи электрофореза и иммунофиксации. Если результаты указанных тестов будут нормальными, электрофорез белков сыворотки крови следует повторять каждые 3–6 месяцев, если же и вновь полученные результаты будут нормальными, электрофорез белков сыворотки крови следует повторять ежегодно. Если будут обнаружены патологические изменения при повторном обследовании или в динамике, такого больного следует направить к гематологу-онкологу.

Если содержание М-парапротеина превышает 25 г/л, нужно обследовать кости (в частности, плечевые и бедренные) на предмет метастазов, а также определить уровень β2-микроглобулина, С-реактивного белка и собрать суточную мочу для исследования по методу электрофореза и иммунофиксации. При подозрении на макроглобулинемию Вальденстрема или другое лимфопролиферативное заболевание следует провести компьютерную томографию брюшной полости, аспирацию и биопсию костного мозга. Если же результаты какого-либо из вышеуказанных тестов будут патологическими, такого пациента следует направить к гематологу-онкологу. На рисунке 3 приведена схема диспансерного наблюдения за больными с нормальными результатами тестов.

Подготовил Богдан Борис

1 Угнетает активность трипсина и других протеолитических ферментов. Дефицит данного белка связан с развитием эмфиземы. (Прим. переводч.)

2 Специфически связывает и транспортирует в плазме неконъюгированный, биологически активный кортизол. (Прим. переводч.)

3 Функция исследована недостаточно, очевидно, принимает участие в транспортировке и поддержании баланса меди в тканях, обладает ферооксидазной активностью, окисляет дополнительные ненасыщенные соединения. Уровень данного белка снижен при болезни Вильсона-Коновалова. (Прим. переводч.)

4 Ингибирует ряд протеолитических ферментов. (Прим. переводч.)

5 Необратимо связывается со свободным гемоглобином, вследствие чего данное соединение выводится из печени, предотвращая потерю свободного гемоглобина с мочой. Уровень данного белка уменьшается при гемолизе, а возрастает при состояниях, сопровождающихся выраженным поражением соединительной ткани и некрозом. (Прим. переводч.)

6 См. также статью „Множественная миелома: диагностика и лечение” // Медицина світу. – 2001. – Т. XI, №. 5. – С. 275–282. (Прим. переводч.)

7 Ревматоидное заболевание, характеризующееся сочетанием клинической симптоматики системной красной волчанки, склеродермии, ревматоидного артрита и миозита (синдромом Рейно, отеком ладоней, артритом/артралгией, нарушением подвижности пищевода, миозитом и легочной гипертензией), а также наличием антител против U1-рибонуклеопротеина. (Прим. переводч.)

Источник

При каких условиях следует проводить электрофорез смеси двух белков если их изоэлектрические точки

Электрофорез сывороточных белков: современные возможности анализа

Гильманов А.Ж., д.м.н., профессор
Саляхова Р.М., к.м.н., доцент
Кафедра лабораторной диагностики ИПО Башкирского медуниверситета, г. Уфа

Информативность и экономичность – важнейшие требования к лабораторным исследованиям, которые приходится учитывать как в отечественной, так и в зарубежной практике. Одним из достаточно информативных лабораторных тестов, используемых в настоящее время, является электрофорез белков биологических жидкостей (сыворотка крови, моча, спинномозговая жидкость и др.), который позволяет получить значительную диагностическую информацию. К сожалению, в большинстве лабораторий нет необходимых приборов. В то же время часть лабораторий, имеющих оборудование для электрофореза, им зачастую не пользуется из-за поломок, отсутствия расходных материалов или, как нередко бывает, невостребованности этого типа анализов лечащими врачами вследствие их недостаточной осведомленности о современных возможностях и клинической значимости этого метода. Исследование белкового и липопротеинового спектра сыворотки крови особенно значимо для диагностики патологических состояний, сопровождающихся нарушениями обмена белков и дислипопротеидемиями. При многих заболеваниях в сыворотке крови изменяется соотношение отдельных белков (диспротеинемия), хотя общее содержание белка может остаться нормальным.

В настоящее время известно более 150 индивидуальных сывороточных белков; значительную часть из них можно количественно определить современными иммуноферментными, иммунохемилюминесцентными и иммунотурбидиметрическими методами. Но при всей информативности и доказательности таких анализов пока они в основном малодоступны из-за сравнительной дороговизны: себестоимость одного количественного определения апопротеинов, антитрипсина или иммуноглобулинов составляет от 2 до 8 долларов США. Вместе с тем типовые сдвиги белкового состава сыворотки крови можно определить гораздо более доступным электрофоретическим методом, который к тому же позволяет «одним взглядом» оценить общую картину белкового спектра и получить значимую диагностическую информацию.

С учетом приведенного выше, при интерпретации результатов клиницистам нет смысла придавать диагностическое значение, например, снижению содержания альбумина у пациента на 2-3% от справочных данных. Само понятие нормы в лабораторной практике весьма условно; нормальные значения параметров зависят от местных факторов и должны формироваться в первую очередь «на местной базе», т.е. в конкретной лаборатории при обследовании здорового контингента. Вместе с тем для общего контроля качества разделения белков выпускаются специальные контрольные сыворотки, которые желательно иметь в каждой лаборатории, работающей этим методом.

Для электрофореза белков используются различные аппараты, как ручные, так и полуавтоматические. Современные комплексы оснащены микропроцессорными блоками питания и управляются компьютером; в большинстве систем на последней стадии исследования окрашенных мембран или гелевых пластинок (определения относительного количества белков в каждой фракции) используется электронный цветной сканер или миниатюрная фотокамера, что существенно повышает точность и воспроизводимость результатов. Программное обеспечение дает возможность усредненного расчета оптической плотности отдельных фракций путем автоматического определения границ «дорожек» и многократного сканирования каждой из них в нескольких «разрезах», что позволяет исключить ошибки из-за локальных микродефектов и неровного положения носителя, а также до определенной степени нивелировать искривление дорожки и влияние окрашенного фона при неполной отмывке. На экран дисплея и на принтер выводится график-денситограмма с рассчитанным содержанием отдельных белковых фракций. При необходимости маркеры границ фракций на графике можно скорректировать, при этом будет произведен автоматический пересчет их показателей. В компьютере, как правило, создается архив электрофореграмм; их можно в любое время извлечь и просмотреть.

Электрофорез белков, позволяющий определить их количественные сдвиги и физико-химические характеристики, помогает выявить заболевания печени и почек, иммунной системы, некоторые злокачественные новообразования (лейкозы), острые и хронические инфекции, генетические поломки и др. Известен ряд своеобразных электрофоретических «синдромов» – типичных картин электрофореграмм, характерных для некоторых патологических состояний. Среди них можно отметить:

Ниже представлены примеры интерпретации данных исследования сыворотки крови нескольких пациентов, проведенного с помощью устройства электрофореза с анализатором электрофореграмм УЭФ-01-«Астра» производства НПЦ «Астра» (г. Уфа).

Электрофоретические методы в клинической лабораторной диагностике имеют хорошую перспективу. Так, среди новинок можно отметить автоматические системы капиллярного электрофореза, которые выполняют быстрое разделение биомолекул внутри капилляра под действием высокого напряжения; для таких приборов требуются уже не микролитры, а нанолитры образца. В целом использование современных электрофоретических анализаторов позволяет с высокой точностью и минимальными затратами исследовать широчайший спектр биохимических параметров с целью уточнения диагноза, мониторинга патологического процесса и обоснования методов терапии заболеваний.

Источник

При каких условиях следует проводить электрофорез смеси двух белков если их изоэлектрические точки

Лабораторная работа №8

ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ

Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.

Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» — электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ

Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.

Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние — концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),

Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза

через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 — 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, — уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.

Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 — 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 — 8,9) при градиенте потенциала 3 — 5 В/см (120 — 350 B для полос длиной 40 — 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 — 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге — прогорание бумаги

Реактивы:

1. Буферный раствор. Можно использовать:

а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;

б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;

в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.

2. Растворы для окраски электрофореграмм:

а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) —0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) — 100 мл + метиловый спирт — 900 мл;

б) бромфеноловый синий —0,5 г, сулема —10 г, уксусная кислота (ледяная) — 20 мл, дистиллированная вода — 980 мл;

в) бромфеноловый синий — 0,1 г, ZnSO₄·7H₂O —50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода — 900 мл.

3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:

а) уксусная кислота — 2 %-й раствор;

б) уксуснокислый натрий — 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.

4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:

а) для извлечения бромфенолового синего —0,01 Mраствор NaOH;

б) для извлечения кислого сине-черного красителя —0,1 Mраствор NaOH.

Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.

Получение сыворотки крови. 2 — 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 — 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.

Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18×45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 —5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы —2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 —8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.

Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 — 0,02 мл (1 — 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 — 24 ч при напряжении 200 — 300 B

Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем — в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 — 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 — 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 — 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.

Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 —5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.

Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций

Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.

Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат — соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

Источник